发布时间：2026-01-02 22:19:45
作者：PG电子模拟器
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活体荧光显微镜已成为一种在体可视化细胞过程的强大技术。然而，由于其尺寸限制，所需的物镜难以物理接触小鼠内脏器官的各个组织部位。采用渐变折射率（GRIN）透镜的小直径探针，扩展了传统活体显微镜的功能，使其能够对内部器官进行微创成像。本方案详细描述了前视和侧视GRIN探针的制备步骤，以及将探针集成到共聚焦显微镜中并操作以可视化小鼠各器官中荧光细胞和微血管系统的方法。完成此方案需要具备一定的光学装置搭建经验。本文还展示了肾移植免疫细胞和结肠肿瘤发展的纵向成像结果。探针的制备与集成可在5至7小时内完成，一次典型的活体成像会线小时。
活体荧光显微镜已被用于研究多种体内细胞水平的过程，如细胞迁移、细胞间相互作用和血管变化。然而，由于这些仪器所需的物镜体积较大，其应用大多局限于浅表组织，如皮肤，或已暴露的内部器官。为客服这一限制，基于微型光学探针的内窥显微技术得以发展，为在完整器官中对组织进行微创探查提供了可能。使用市售的GRIN透镜可以方便地制备出尺寸（长度和直径）适合小动物微创高分辨率成像的高质量微型光学探针。前视GRIN探针允许在开腹手术后对内部器官进行活体成像。侧视探针非常适合于通过自然孔道对管状器官（如胃肠道和呼吸道）的粘膜进行成像。
微光学和光纤技术的进步催生了几种稳健的微型光学探针设计策略和来自例如宾得、卡尔史托斯、莫纳克亚科技和奥林巴斯等公司的商用仪器。宾得与Optiscan制造的共聚焦内窥显微镜提供与GRIN探针相似的空间分辨率，但其扫描光纤探针的直径相对较大（大于3.5毫米）。奥林巴斯的微型物镜直径更窄（1.3至3.5毫米），但该物镜具有固定的焦平面，限制了其在活体成像中的应用。卡尔史托斯的Coloview内窥镜专为在宏观尺度上追踪结肠肿瘤进展而优化。莫纳克亚科技商业化了一种手持式柔性光纤探针，但其空间分辨率通常低于GRIN探针，并且局限于光纤束的表面。相比之下，GRIN探针在三个维度上都提供显微分辨率，适用于细胞研究。因此，它允许对厚组织进行光学切片，同时其机械刚性可在组织表面成像期间提供良好的位置稳定性。此外，通过在探针尖端附加棱镜反射镜能改变视角（例如，偏转90°以实现对管腔器官的高分辨率侧视成像）。GRIN光学探针具有小直径（0.35至1毫米）、适中长度（20至100毫米）和高数值孔径（NA；0.4至0.6）的特点，是小动物模型（如小鼠）微创成像的有用工具。
与传统的共聚焦荧光显微镜一样，GRIN探针在大多数软组织中的光学穿透深度限制在约100微米。利用双光子成像和在近红外区域发射荧光的荧光团，穿透深度可提高二至三倍。尽管本文描述的共聚焦内窥显微技术非常适合于对器官外层（即皮质或粘膜）进行成像，但对于更深或更内部的区域（如髓质），若不造成过度的组织损伤，光学探针则不易触及。到达深层组织的一个潜在解决方案是将探针物理插入目标部位。通过仔细的插入操作，可以将对周围组织的附带损伤降至最低。另一个局限性源于探针的机械刚性，这使得它难以深入肠道（例如小肠）和呼吸道（例如支气管）。通过精心设计的手术方法，例如使用类似饲管的插管，能减轻这一限制。此外，探针的视场通常与GRIN透镜的直径成正比，并且相对于标准物镜来说较小。因此，GRIN探针不适合宏观成像。这一局限性能够最终靠顺序扫描探针以获取大面积的拼接图像来部分克服。
GRIN探针的关键设计参数。GRIN探针的最佳设计预计会因具体成像的目标组织而异。关键设计参数包括观察方向、物理尺寸以及视场和分辨率等成像参数。就观察方向而言，探针可分为前视型和侧视型。在图1中，我们展示了前视和侧视探针中的光路，每种都包含三个GRIN透镜：耦合透镜、中继透镜和成像透镜。侧视探针在其末端有一个棱镜反射镜。通常，前视探针更适合对腹腔和胸腔内的大多数器官以及其他能与探针末端接触的组织（如淋巴结）进行成像。侧视探针则更适合对胃肠道和呼吸道的粘膜进行成像。一般指导原则总结于表1。
图1 GRIN光学探针示意图。(a) 前视光学探针。一个0.25节距的耦合透镜从输入端收集光线（来自左侧）并将其准直到中继透镜上。准直后的输出光被导向成像透镜，成像透镜起到成像作用。红线表示光线传播的路径。当入射光的焦点进行光栅扫描时，经过成像透镜后的焦点位置也相应改变。(b) 侧视光学探针。红线展示了光线追迹。一个棱镜被粘接在成像透镜的抛光面上，将光线导向侧方。(c) 单个GRIN透镜和棱镜的照片。
探针的直径应足够小，以便微创进入目标组织。市售GRIN透镜的直径范围从0.35毫米到2毫米。增加保护性金属套管会使直径增加约0.25毫米。探针的长度必须充足长以到达目标组织。低数值孔径中继透镜的最大的目的是提供足够的长度。中继透镜的长度选择为半节距的倍数。然而，随着中继透镜节距的增加，由于透镜中光学像差的增加，空间分辨率往往会下降。此外，探针因过度弯曲而损坏的风险也随着探针长度的增加而增加。因此，需要尽可能减少中继透镜的节距。对于小鼠成像，适用于腹腔器官的探针长度为20至30毫米，适用于胃肠道成像的长度为60至100毫米。
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虽然耦合透镜具有0.25节距，能使输入光束准直，但成像透镜的节距应等于或小于0.25，以使焦点形成于探针的前表面或侧表面或刚好在其外侧。对于前视探针，成像透镜的合适节距为0.23至0.25。对于侧视探针，成像透镜的节距应为0.16至0.17，以补偿附加棱镜反射镜中增加的光程。成像透镜可按定制长度从透镜制造商处购买，或者，通过光学抛光缩短一个0.25节距透镜的长度来制备。对于侧视探针，在成像透镜之后会附加一个斜面上镀有金属（铝或银以获得高反射率）的棱镜，使光线°。建议选择基底能与成像透镜直径匹配的棱镜，以避免封装复杂化。GRIN透镜的选择指南总结于表2。
图1所示GRIN探针的视场约等于透镜直径乘以中继透镜数值孔径与成像透镜数值孔径之比。（显微镜物镜的选择应使成像系统能够适配探针的视场。）图1所示透镜的视场直径为1毫米。根据本方案所述，用这些透镜制作的探针视场约为250微米。成像透镜的数值孔径决定了探针的整体数值孔径。衍射极限的空间分辨率可表示如下：横向分辨率为0.6λ/NA，轴向分辨率为1.1λ/NA²，其中λ为发射波长。GRIN探针的实际分辨率往往比这一理论极限要差，因为GRIN透镜的有效数值孔径会由于透镜中的空间像差而降低1.5至2倍。
本方案描述了制备探针的分步指南。具有一定通用光学经验的个人相对容易进行制备。然而，对于那些在光学抛光和组装方面技能不足或没有必要制备工具的人员，可以从商业服务购买定制设计的光学探针。在这种情况下，本方案可作为定制设计的一般指南。光学元件的组装需要适当的工具，如体视显微镜、镊子、用于紫外线固化环氧树脂的紫外光源以及用于热固化环氧树脂的加热器。为了足够的精度和易于组装，建议使用两个正交方向排列的体视显微镜。在将GRIN透镜抛光至所需长度时，确保两个端面平坦且平行以最小化光学畸变至关重要。这可以通过手动研磨工具和定制夹具来实现。在图2c至e中，我们提供了前视探针制备过程的图示概要，并附有三个代表性步骤的照片。对于侧视探针，需要在成像透镜上附加棱镜，这是一个额外的步骤。避免使用易产生荧光的环氧树脂至关重要，因为它会导致荧光成像中的背景噪声。建议使用光学级紫外线固化环氧树脂来粘合GRIN透镜。完成透镜组装后，建议使用金属套管来加固光学探针，这有助于避免在操作和成像过程中损坏光学探针。金属套管可从商业GRIN透镜销售商处购买。将光学探针插入金属套管后，建议使用热固化环氧树脂将金属套管固定在光学探针上，热固化环氧树脂比紫外线固化环氧树脂具有更高的机械刚性。确保金属套管覆盖所有透镜和棱镜的粘合界面至关重要。
制备好的光学探针需要集成到显微镜系统中。本方案描述了为探针组装机械支架以及将支架连接到定制的激光扫描共聚焦显微镜的步骤。提供了前视探针和侧视探针机械支架的详细设计。前视探针的机械支架应能以1至2微米的精度控制探针在x、y、z方向上的位置。对于侧视探针，还需要具备以5°的精度将探针旋转360°的附加能力。对于首次使用任何光学探针，建议用户测量其光学性能。可以使用市售的荧光微珠来表征视场、空间分辨率和色差。在框2和图5中，我们详细描述了这个过程。对于那些倾向于使用商用荧光显微镜的用户，我们提供了详细的替代方案说明。
所选品系小鼠（7-16周龄）。本方案中使用了野生型C57BL/6小鼠、主要组织相容性复合体II类-GFP小鼠和Tie2-GFP小鼠。关键：所有动物实验必须依据相关伦理准则和规定进行。
可使用复制定制的共聚焦显微镜，或商用正置共聚焦或双光子显微镜。关键：显微镜应在物镜下留有足够的工作空间（大于7-10厘米），以容纳探针座和动物平台。如果空间不足，则需要改装显微镜的样品台。
动物饲养：成像前，小鼠应饲养于可自由获取食物和水的笼中。笼内应有适当的温湿度控制、通风和定期清洁。成像后，小鼠应置于温暖环境中，观察直至从麻醉中恢复。
/甲苯噻嗪溶液：在无菌条件下混合1毫升、0.15毫升甲苯噻嗪和8毫升无菌生理盐水。混合体积可根据小鼠数量和体重进行调整。关键：该溶液应在配制当天使用。
荧光染料：将FITC-葡聚糖或TAMRA-葡聚糖溶解于无菌5%生理盐水中，并通过0.45微米注射器滤膜过滤。溶液可分装（100微升）并储存在避光小瓶中供后续使用。典型的储存时间在-20°C下为1个月，在-80°C下为6个月。
高温环氧树脂：在铝箔上混合触变性环氧树脂（A组分）和高温环氧树脂（B组分）。关键：该混合物应在当天、即将安装金属套管前配制使用，因为环氧树脂聚合固化甚至在室温（18–20°C）下即开始。
金属套管：使用内径1.02毫米、外径1.25毫米的不锈钢套管作为金属套管，以在日常操作和成像过程中保护光学探针的连接点。需要切割和修整金属套管至所需长度，使其足以覆盖制备好的光学探针的连接点，但不超过其总长度。金属套管可用研磨机准备。或者，GRINTECH或当地机械加工店提供商业金属切割服务。注意：切割和研磨金属管时需小心避免人身伤害。
夹具：移除SMA连接器的塑料部件后，将抛光盘与具有1.03毫米孔径的SMA连接器连接。
侧视探针支架：将用于固定光学探针的定制不锈钢管插入一个已粘接到定制不锈钢轴承套圈上的滚珠轴承中。使用紧定螺钉将旋转皮带轮连接到该管上。关键：由于尺寸小，将光学探针通过通孔插入支架时必须小心操作。光学探针支架的外径需与xy平移台的内螺纹匹配。
前视探针座：如图所示，使用两根组装笼杆和一个笼式转接座，将xy平移台安装到单轴平移台上。
侧视探针座：探针座设计用于提供侧视光学探针的旋转和平移。组装附件座的详细步骤如图所示。简言之，将带有旋转皮带轮的探针支架连接到xy平移笼式安装座上。通过同步带、笼式安装转接件和笼式组装杆将旋转轴连接到探针支架和xy平移笼式安装座。组装好的座通过两根笼杆和一个笼式转接座连接到单轴平移台上。
物镜座的组装：显微镜物镜和探针座安装到一个笼式立方体上。显微镜物镜具有独立的聚焦控制，即z轴平移台，用于手动移动物镜的焦平面。
定制共聚焦显微镜：成像系统是定制的视频速率扫描激光共聚焦显微镜。系统使用491、532和635纳米波长的连续波激光器进行单光子荧光激发。使用银镜和二向色分束器来选择激光束并将其引导至由镀银多面体扫描仪和振镜组成的光栅扫描器。当使用40倍物镜时，显微镜设计视场为250–300微米。使用三个光电倍增管分别收集三个荧光通道的荧光信号。一个八位四通道图像采集卡以每秒20兆的采样率对PMT信号进行数字化，每帧为512 x 512像素。使用定制软件实时显示和保存获取的图像，帧率为15–30赫兹。
2 调整俯视体视显微镜和侧视体视显微镜的焦点，使其重合于已安装中继透镜的顶面。
3 将31号注射器针尖部分浸入紫外线固化环氧树脂中，提取一小滴紫外线 通过体视显微镜观察，小心地仅使注射器针尖的环氧树脂液滴接触中继透镜表面，将约1 µl的紫外线固化环氧树脂涂抹在中继透镜表面的中心部分（图2c）。
关键步骤： 小心避免注射器针头损伤中继透镜表面。熟练的实验员可手动完成此步骤。对于不熟练的实验员，使用带有固定注射器针头的xyz微米台可能会有帮助。此外，环氧树脂用量过多可能导致下一步骤中透镜界面的倾斜。如果涂抹过多，可使用浸有100%甲醇的镜头清洁纸去除多余环氧树脂，然后重复步骤3和4。在重复步骤3之前，务必通过俯视体视显微镜确保中继透镜表面没有残留的环氧树脂或灰尘。
5 使用镊子将耦合透镜放置在中继透镜顶部，并通过体视显微镜观察以确保耦合透镜和中继透镜正确对准（图2c）。
关键步骤： 此步骤会显著影响光学探针的成像性能。建议使用体视显微镜将透镜的对准精度控制在30 µm以内。如果观察到未对准，可使用镊子轻轻触碰耦合透镜以纠正位移。如果观察到倾斜，请使用浸有100%甲醇的镜头清洁纸清洁透镜表面，并减少环氧树脂用量，从步骤3重新开始。
6 使用手持式紫外固化灯（90 mW cm⁻²，365 nm）在透镜界面处照射5分钟，使环氧固化。对于前视光学探针，直接进行步骤15。对于侧视探针，继续步骤7。
注意：佩戴紫外线防护眼镜。避免紫外线直接照射实验人员，因为紫外线会严重损害视网膜和皮肤。
8 将5 µm抛光膜放置在湿润的抛光垫上。抛光膜应牢固地附着在抛光垫上。
9 在抛光膜上施加足够的蒸馏水以浸湿整张膜，然后用干净的纸巾吸去多余水分。
10 将抛光盘放置在湿润的抛光膜上，并使用镊子将成像透镜插入抛光盘的套圈孔中（附图1）。
11 将一个图钉插入同一个套圈孔，并置于成像透镜上方。这是为了确保GRIN透镜在抛光过程中保持原位并与抛光膜接触。
12 沿类似阿拉伯数字8的路径滑动抛光盘20–50次来抛光成像透镜，然后用卡尺测量成像透镜长度的变化。
13 重复步骤10–12，直到成像透镜比所需长度长约0.1毫米（例如，目标长度为1.7毫米时，抛光至约1.8毫米）。
14 使用1 µm抛光膜重复步骤7–13，直到达到所需长度。使用体视显微镜检查表面质量和平整度。
关键步骤： 此步骤会显著影响成像质量。使用体视显微镜检查表面是否平整、洁净。可用浸有100%甲醇的镜头清洁纸清洁透镜表面。
16 对成像透镜重复步骤2–6。对于前视光学探针，继续本操作步骤的步骤20。对于侧视光学探针，进行步骤17。
17 重复步骤3，通过体视显微镜观察，小心地仅使注射器针尖的环氧树脂液滴接触中继透镜表面，将约1 µl的紫外线固化环氧树脂涂抹在成像透镜表面的中心部分（图2f）。
19 通过前视体视显微镜观察，用镊子轻轻触碰棱镜反射镜进行调整，使棱镜与成像透镜的圆形表面内切对齐，然后重复步骤6。
关键步骤： 小心不要损坏棱镜的矩形侧面。过多的胶水应用镜头清洁纸去除，因为它可能会妨碍探针插入金属套管（步骤20）。
20 将组装好的光学探针插入准备好的金属套管中。组装好的光学探针应能平滑无阻力地滑入金属套管。
21 将注射器针尖浸入高温环氧树脂中，用该环氧树脂填充插入的光学探针与金属套管之间的缝隙。对于侧视光学探针，用环氧树脂密封棱镜边缘以形成光滑表面（图2j）。
关键步骤：小心避免环氧树脂覆盖光路或残留在金属套管外部。位于激光束焦点处的高温环氧树脂可能会产生强烈的自发荧光，导致成像过程中出现不必要的背景噪声。
22 将套有套管的光学探针置于120 °C的加热垫上保持2小时。这将使高温环氧树脂固化。
注意： 加热垫可能导致灼伤。处理带套管的光学探针时请使用镊子，并避免加热垫直接接触皮肤。
23 将光学探针固定在具有三轴平移控制（侧视光学探针还需具备旋转控制）的定制支架上（参见图3、图4、设备配置和补充视频1）。
关键步骤： 将探针插入支架并固定的操作需极其小心，因为弯曲或应力可能导致GRIN透镜之间的环氧胶粘剂损坏或透镜本身破裂。
24 调整光学探针耦合透镜的近端表面位置，使其与显微镜物镜的焦平面重合（补充视频2）。
关键步骤： 此步骤需要通过调整探针支架和z轴平移台，将光学探针相对于物镜精确对准。建议使用荧光信号作为对准的反馈。在探针远端表面滴一小滴含有大荧光微球的溶液（直径10–20 µm）。调整光学探针支架以使荧光信号最大化。确定此位置后，用生理盐水洗掉探针表面的微球。探针性能的详细表征可参见框2。在我们的定制共聚焦显微镜中，也可以暂时移开发射滤光片，利用反射的激发光成像光学探针表面，作为探针对准的反馈。
25 调整聚焦控制旋钮，使物镜的焦平面置于光学探针内部，距近端表面30–50 µm深度处。这将使GRIN探针的成像平面位于探针远端表面外约30–50 µm处（在空气中；或在折射率为1.5的样品中，位于约20–35 µm处）。此设置有助于用户通过观察图像判断探针是否与样品或组织接触。
26 通过腹腔注射/甲苯噻嗪溶液麻醉小鼠（75 mg kg⁻¹，甲苯噻嗪15 mg kg⁻¹），等待2–3分钟直到小鼠充分麻醉。
29 如有必要，在皮肤和腹膜上做一个3至5毫米的切口。如果光学探针是通过自然开口（如结肠）插入，则无需此步骤。
关键步骤： 此步骤对于冲洗掉自然废物或手术痕迹（如血液）以及润滑目标组织非常重要。对于结肠组织，使用带橡胶头的注射器注入约0.5 ml生理盐水冲洗数次，注意不要引起出血。
31 （可选）如果需要对血管进行荧光标记，可静脉注射100 µl TAMRA-葡聚糖或FITC-葡聚糖。
33 移动平移台上的小鼠，使光学探针能够通过切口或自然开口插入并到达目标组织（补充视频3）。
关键步骤： 为避免组织损伤（如出血），请勿用光学探针按压目标组织。此外，应注意不要因推压组织而使光学探针弯曲，因为这可能导致探针内的单个GRIN透镜破裂或损坏透镜间的环氧胶粘剂。
34 调整激光功率和光电倍增管增益，直到获得足够的信噪比。尽可能保持较低的激光功率，以防止光漂白和组织损伤。
35 通过改变焦点、小鼠台位置和旋转（仅侧视光学探针）来获取图像或电影。
36 如果需要，用尼龙缝合线闭合切口，并给予镇痛药。对于通过自然开口进行的侧视成像，无需缝合。
关键步骤： 对于纵向研究，最大限度地减少重复麻醉和手术干预对动物造成的应激和感染至关重要。
步骤7–14：将成像透镜抛光至设计长度（仅适用于侧视探针；无经验操作者可能需要更长时间）：1小时
我们的研究表明，在体对内脏器官进行细胞水平的微创成像，是理解在体生物学、疾病机制以及新疗法有效性的有力工具。成功完成本方案，将通过将制备或购买的GRIN探针集成到用户可用的显微镜中，为用户提供这样一个成像系统。此处描述了本方案各步骤的预期结果。
在开始制备光学探针之前，根据特定目标器官确定最佳设计方案非常重要。通用设计和选择指南总结于表1和表2。图1分别展示了前视和侧视三合GRIN探针的原理与组件。成功完成制备步骤后，将产生一个长度为20–35毫米的前视探针或一个长度为60–100毫米的侧视探针，如图2i所示。完成图3、图4或图6所示的组装步骤后，将形成一个基于光学探针的完全集成的成像系统。
基于前视探针的内窥显微系统将允许用户在微创开腹手术后对内脏器官进行荧光细胞成像。图7展示了使用各种器官（如小肠、脾脏、肾脏、肝脏、膀胱和输尿管）获得的示例性结果。在图7a–f中，我们使用了一种转基因小鼠，其中绿色荧光蛋白在MHCII启动子驱动下表达。可以观察到呈绿色的MHCII+、GFP+抗原呈递细胞，血管系统则通过静脉注射的染料-葡聚糖偶联物进行可视化。在图7g,h中，对Tie2-GFP转基因小鼠进行了成像，其中血管内皮细胞通过GFP荧光显示。通过在成像过程中最好能够降低手术切口，可以在多个时间点对同一小鼠进行重复成像。为了说明这种可能性，我们在肾移植小鼠模型中对免疫细胞进行了连续成像。从C57BL/6背景品系的MHCII-GFP小鼠获取供体肾脏，然后移植到BALB/C背景品系的野生型小鼠体内，并使用前视探针监测肾移植中供体表达GFP的抗原呈递细胞。肾脏组织表达出相对较强的自发荧光，从而显示了皮质的肾小管。移植后第1天，观察到大量树突状GFP+供体抗原呈递细胞（图8a）。第3天时，大多数树突状GFP细胞已进入包膜，这表明了清除过程（图8b）。与移植器官相比，肾脏包膜的自发荧光水平也能指示组织的活力（图8c,d）。此外，延时成像可以跟踪免疫细胞在肾脏中的迁移（附图5）。
带有侧视探针的内窥显微系统将使用户能够通过自然孔道对管状器官（如胃肠道和呼吸道）的粘膜进行无创成像。图9展示了降结肠的示例性成像结果，显示了荧光标记的细胞和血管。在进行结肠成像前，小鼠需禁食24小时以排空结肠，并在成像前立即轻扫小鼠腹部朝向直肠方向以挤出结肠内残留的粪便。麻醉后的小鼠背卧位放置在平板上，肛门朝向光学探针，并通过xyz平移台缓慢移向探针。通过将光学探针的观察窗朝向腹侧，可以观察到探针尖端在结肠内的位置。监控插入动物体内的光学探针长度有助于位置记录。使用定制的探针支架，可以使光学探针沿粘膜旋转和平移。一旦光学探针就位，用户即可在计算机显示器上观察图像并进行记录。图9a–c展示了使用侧视光学探针在降结肠正常粘膜处拍摄的荧光图像，显示了MHCII+、GFP+细胞、沿隐窝结构排列的上皮细胞以及通过血液中的FITC-葡聚糖显示的血管系统。通过对组织大面积进行探针扫描（速度100–200 µm s⁻¹），获得了血管系统的三维数据集。通过对单个图像进行旋转和配准，可以构建大面积拼接图像（图9d）。该数据集可以以多种模式呈现，例如穿行演示（图9e）。通过使用类似的程序，可以从上消化道和呼吸道获取血管系统和细胞图像。
侧视光学探针非常适合于在自发性结直肠癌小鼠模型中跟踪结直肠肿瘤的发展。我们使用了一种转基因小鼠模型，其中结肠粘膜肠道细胞中的腺瘤肉病基因能够最终靠给予腺病毒Cre来敲除。Apc基因失活后，报告基因GFP被激活，从而使得能够通过侧视荧光内窥显微技术长期跟踪和量化结肠中Apc突变细胞的生长。通过使用侧视光学探针和前述成像程序，我们在病毒递送Cre后4周观察到了多个表达GFP的息肉（图10a）。血管系统通过静脉注射TAMRA-葡聚糖同时可视化。在此阶段，检测到两个直径为50–150 µm的微小结节，其中观察到明显的血管系统变化。两周后，可以在距肛门大致相同距离处识别出同一区域，并发现其中一个结节已生长至直径约400 µm（图10b）。可以清楚地观察到结节周围血管的扩张。注射的染料可能从肿瘤的可渗透血管中渗出，这使得在短时间内重复成像血管系统变得困难。
共轭平面：一个空间点通过一组光学透镜被中继到第二个共轭/对应空间点。为了实现最佳的激光束引导，使用4f共轭透镜系统将光束导向镜上的枢轴点中继到显微镜物镜后焦平面的中心。
焦平面：对于从无穷远聚焦的光线，成像所在的平面，该平面位于距光学系统中心一个焦距的位置。
GRIN透镜（渐变折射率透镜）：一种圆柱形玻璃棒，其折射率沿径向呈抛物线函数递减。GRIN透镜能够聚焦、准直和中继光束，类似于透镜波导。
数值孔径：一个无量纲数，表示显微镜物镜的分辨能力。该数值由显微镜物镜前方介质的折射率与系统能够接受或发射光线的半角正弦值相乘得到。
光学像差：光学系统中的失真，与理想系统相比降低了光学性能。它们可能由于光学元件（如透镜和反射镜）的未对准或物理缺陷而产生。色差是指由于波长变化引起的焦平面偏移。
节距：GRIN透镜的长度，在此长度内，单条光线将传播一个完整的正弦周期。
空间分辨率：成像系统能够分辨为独立实体的样本上两个空间分离点之间的最短距离。
能够正常的使用荧光样品测量视场和空间分辨率。使用多色荧光样品可以量化色差。获取空间分辨率和视场的详细数学背景可参阅相关文献。建议在首次使用前进行这些测量以测试光学探针的质量，测量可以按任意顺序进行。
测量视场是为了在图像中建立准确的比例尺。对于按照主要操作步骤使用1毫米直径SRL和ILW透镜制作的前视探针，视场约为250 µm。所述侧视探针的视场约为270–280 µm。
1. 将大荧光微球（直径10–20 µm）在水中稀释，取10 µl滴加在盖玻片上，空气干燥20分钟。
3. 在视场中选择一个荧光微球，横向移动样品台将该微球定位在视场边缘，记录此时样品台的位置。
4. 沿x或y方向移动样品台，将荧光微球重新定位到相反方向的视场边缘。记录样品台位置。
6. 或者，可以使用尺寸已知（例如20 µm荧光微球）且远大于成像分辨率的荧光样品来测量视场。
建议测量空间分辨率以确认制备探针的性能。横向分辨率可以通过单个0.2 µm荧光微球的最佳聚焦图像轻松测量。其x轴或y轴强度剖面的半高全宽对应于横向分辨率。测量轴向分辨率的步骤更为复杂，如下所述。GRIN探针典型的横向和轴向分辨率分别为1 µm和10–15 µm。如果测得的分辨率远高于这些值，则可能需要更换光学探针。
1. 将0.2 µm荧光微球在水中稀释，取10 µl滴加在盖玻片上，空气干燥20分钟。
4. 以0.5–1 µm的步长对荧光微球进行z轴堆栈成像，直到检测不到荧光。通常，20 µm的z轴扫描足够。
5. 绘制荧光强度随z轴变化的曲线，测量强度剖面的半高全宽，该值即定义为轴向分辨率。
在多色荧光成像中，了解GRIN探针的色差很重要，因为不同激发波长之间的焦点偏移必须得到补偿。为了补偿色差引起的焦点偏移，应在改变激发波长时调整物镜的焦点位置。将物镜在不同位置时、各激发波长下拍摄的最佳聚焦图像合并为一张复合图像。通常，491纳米和532纳米两种激发波长的焦平面会相差约20–40 µm，具体取决于GRIN透镜的类型和长度。表征和补偿焦点偏移的步骤如下：
1. 将4 µm多色荧光微球在水中稀释，取10 µl滴加在盖玻片上，空气干燥20分钟。
5. 第一和第二焦点位置之间的差异是由光学探针的色差引起的焦平面偏移所致，它代表了两个波长之间的色差焦点偏移。分别将第一焦点位置获得的绿色通道图像和第二焦点位置获得的红色通道图像合并，即可得到色差补偿后的双色图像。
将GRIN光学探针集成到现有显微镜系统中，可对主要操作步骤的23–25步进行最小化修改来实现。这里我们描述两种集成到标准正置显微镜系统的方法。简言之，可以使用安装在xyz平台上的微型V型夹来固定前视探针。相比之下，可以利用探针座转接器和简单的4f透镜中继系统，对传统的正置或倒置显微镜进行改装，以安装侧视探针。
如图6a所示，使用标准的1/2英寸立柱和立柱支架将微型V型夹安装到三轴电动平移台上。前视光学探针用微型V型夹固定到位。或者，也能够正常的使用手动平台来固定微型V型夹。
可以构建一个额外的侧视成像光路来容纳相关的中继光学器件。侧视探针座的作用是将位于商用物镜座附近的共轭扫描平面翻转90°，并将其中继到显微镜物镜的后焦平面上。图6b展示了用于正置显微镜的转接器示意图。使用银镜反射从显微镜座出射的光线。共轭扫描平面通过一个4f透镜系统中继到显微镜物镜的后焦平面上。第一个透镜放置在距扫描平面一个焦距的位置。第二个透镜放置在距第一个透镜两个焦距的位置。显微镜物镜的后焦平面放置在距第二个透镜一个焦距的位置。相同的转接器也可用于倒置显微镜（未显示）。图6c显示了座组件的详细布局，其大部分与图4c所示相同。图6d显示了侧视探针在正置显微镜中的完整组装。
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